تقنيات حديثه في دراسات حيويه

-

التقنيات الحديثة في الدراسات التقانية الحيوية 

غالية أبو الشامات،  سمير أبو إصبع

تُعد التقانة الحيوية biotechnology تخصصاً واسعاً يجري فيه استغلال العمليات البيولوجية أو الكائنات الحية والخلايا أو المكونات الخلوية لتطوير تقنيات حديثة modern techniques في مجالات تطبيقية عدة مثل: التشخيص الطبي والصحة والصيدلة وتحسين الصناعات الغذائية والزراعة وفي التقانات التي تعتمد على الـ DNA المأشوب وغيرها. وقد طور العلماء أدوات وأجهزة جديدة مفيدة في تلك المجالات، وأبرز تلك التقنيات وتطبيقاتها ما سيأتي:

1-  مصفوفة الحمض النووي الدقيقة  MicroarrayDNA

هي تقنية تُربط فيها آلاف الجزيئات من الحموض النووية بسطح محدد، ويقاس التركيز النسبي لها في المزيج بعد عملية التهجين hybridization. يعتمد المبدأ الأساسي في هذه التقنية على مبدأ التهجين بين اثنين من سلاسل الحمض النووي، ويجري الارتباط بين السلسلتين وفق مبدأ التتامية وتكوين روابط هدروجينية بين أزواج الأسس النكليوتيدية المتتامة فقط.

وهناك ثلاثة أنواع أساسية من المصفوفات:

أ‌- مصفوفات مرقطة على الزجاج spotted on glass، حيث يُغمس «قلم» (أو أقلام متعددة) في محاليل تحتوي على الحمض النووي المدروس ويُرسب فعلياً على شريحة مجهر زجاجية. وعادة ما يُغطى سطح الشريحة الزجاجية بمادة للمساعدة على الاحتفاظ بالحمض النووي مثل البولي لايسين polylysine، أو السيلان  silane.

ب‌- مصفوفات ذاتية التجميع  self-assembled تعتمد على ربط مجموعة من الخرزbeads  المحتوية على مجموعة متنوعة من أحاديات النكليوتيد (الأوليغوس oligos) بسطح ذي حفر بحجم الخرز. وتحدد سلسلة من عمليات التهجين مكان ارتباط أحاديات النكليوتيد.

ج‌-   مصفوفات التركيب في الموقع in-situ synthesized، وفيها يُحقن أحادي النكليوتيد ويُركَّب في الموقع. يوضح الشكل (1) الأنواع الثلاثة للمصفوفات.

الشكل (1) الأنواع الثلاثة للمصفوفات.

بنية المصفوفة الدقيقة

المصفوفة شرائح دقيقة، حجمها دقيق جداً، وتتكون من سطح صلب، يُصنع غالباً من الزجاج، يحوي بداخله حفراً spots، تحتوي كل حفرة على مسبار  probeبطول 10-100 نكليوتيد خاص يُصنّع لدراسة جين واحد فقط، ومختلفة عن غيرها من الحفر المجاورة التي تكون لدراسة جين آخر مختلف. ورُتبت آلاف الحفر بشكل صفوف وأعمدة على وسط زجاجي، لتُسجل بياناتها (تسلسلها وتوضعها في الشريحة) ببرنامج حاسوبي متخصص قادر على تحليل النتائج الهائلة للتعبير الجيني لآلاف الجينات دفعة واحدة ( الشكل 2 – أ و ب).

(أ)  شريحة الحمض النووي المستخدمة في تحديد النمط الجيني.  (ب) رسم توضيحي لبنية المصفوفة الدقيقة. الشكل (2) المصفوفة الدقيقة.

وتُستخدم مصفوفات الحمض النووي الدقيقة في الاختبارات التشخيصية السريرية لبعض الأمراض. وتُستخدم في بعض الأحيان أيضاً لتحديد الأدوية التي يمكن وصفها على نحو أفضل لأفراد معينين.

ومن أبرز تطبيقات هذه التقانة الكشف عنالتعبير الجيني gene expression؛ إذ تُستخدم هذه التقنية للكشف عن أنماط التعبير الجيني في خلية محددة أو في نسيج معيّن، فمثلاً يكون تعبير الجينات الكابحة للورم tumor suppressor genes  في الخلايا السوية عالياً جداً مقارنة مع تعبيرها في الخلايا السرطانية؛ إذ تقوم تلك الجينات  بالحد من الانقسامات الخلوية المستمرة، فتحميها من أن تتحول إلى خلايا سرطانية، وعلى النقيض منها يكون تعبير الجينات الورمية oncogene في الخلايا السوية محدوداً مقارنة بتعبيرها في الخلايا السرطانية.

فإذا وُجدت عينتان (الشكل 3): الأولى من خلايا سوية normal cells، والثانية من خلايا سرطانية cancer cells، في البداية ستُزرع هذه الخلايا على وسط صنعي لتنميتها وزيادة عددها. ثم يُعزل الرنا المرسال mRNA، ويُستخلص من كلتا العينتين كل على حدة، ثم يُحول mRNA إلى دنا متمم cDNA بفعل النسخ العكسي reverse transcriptase. وتُضاف صبغة مضيئة لكل cDNA لتعطي لكل جين لوناً مختلفاً فمثلاً اللون الأخضر يلون cDNA الخلايا السوية، واللون الأحمر يلون cDNA، الخلايا السرطانية، ثم توضع cDNA الخليتين السوية والسرطانية على الشريحة الدقيقة ذاتها، وهنا سيتعرف cDNA الموسوم على المسبر ذي التسلسل المتمم له والموجود في إحدى الحفر، وهذه العملية تُسمى بالتهجين hybridization، وبالنتيجة ستظهر ثلاثة ألوان: اللون الأحمر يدل على وجود تعبير للجين في الخلايا السرطانية، واللون الأخضر يدل على التعبير في الخلايا السوية. أما اللون الأصفر فيعني أن التعبير موجود في النمطين الخلويين كلاهما، وفي حال أن الحفرة لم تعطِ أي لون فهذا دليل على عدم وجود تعبير للجين سواءً في الخلايا الطبيعية أم السرطانية. وتجدر الإشارة إلى أن شدة اللون في الحفرة تدل على كمية التهجين، فكلما كانت الشدة عالية كان التعبير الجيني عالياً.

الشكل (3)

استُخدمت المصفوفات الدقيقة على نطاق واسع في التنميط الجيني genotyping، وبصورة خاصة للكشف عن التعدد الشكلي أحادي النكليوتيد Single-Nucleotide-Polymorphism (SNP). ويوضح الشكل (4) إحدى الطرائق المستخدمة في التنميط؛ إذ تُرفق كل خرزة beadبتسلسل مكون من 50 نكليوتيداً متمماً للتسلسل المجاور لموقع التعدد الشكلي أحادي النكليوتيد المراد دراسته. ثم يرتبط الامتداد الأحادي الأساس (Tأو G) المتمم للأليل الذي يحمله الحمض النووي (Aأو C، على التوالي) وينجم عنه إشارة ملونة بشكل مناسب (حمراء أو خضراء، على التوالي). تقوم الخوارزميات الحسابية بتحويل الإشارات الخام إلى استنتاجات تتعلق بوجود كل من الأليلين أو عدم وجودهما.

الشكل (4) إحدى طرائق التنميط.

من مزايا تقانة المصفوفة الدقيقة أنها توفر دراسة آلاف الجينات في الوقت ذاته كما أنها سهلة وسريعة العمل لإظهار النتائج، لكن من عيوبها الحصول على بيانات كبيرة تستغرق وقتاً طويلاً جداً لتحليلها. وكذلك توفر مقياساً غير مباشر للتركيز النسبي؛ إذ إنه في كثير من الأحيان لا يتناسب خطياً مستوى الإشارة في موقع معيّن على المصفوفة مع تركيز الجزيئات المهجنة: فعند التراكيز العالية ستصبح المصفوفة مشبعة وبتراكيز منخفضة. ومن مساوئ التقانة أيضاً حدوث ارتباطات غير نوعية خاصة بالجينومات في الثدييات المعقدة، إذ إنه غالباً ما يكون من الصعب (إن لم يكن من المستحيل) تصميم مصفوفات لا ترتبط فيها تسلسلات الحمض النووي/الحمض النووي الريبي المتعددة ذات الصلة بالمسبار نفسه على المصفوفة نتيجة وجود تسلسلات كثيرة متشابهة. وهذا يمكن أن يمثل مشكلة خاصة للعائلات الجينية وللجينات ذات المتغيرات المتعددة.

وبالنظر إلى قيود المصفوفات المذكورة أعلاه سيكون من الأفضل بكثير وجود طريقة غير متحيزة لقياس جميع أنواع الحموض النووية الموجودة في عينة معينة مباشرة. الأمر الذي أدى إلى ظهور تقنيات أخرى مثل السلسلة من الجيل التالي.

2- سَلسَلة الدنا DNA sequencing

تُستخدم تقانة سلسلة الحمض النووي الطرائق الكيميائية الحيوية من أجل تحديد الترتيب الصحيح للأسس النكليوتيدية في الحمض النووي باستخدام أجهزة سلسلة خاصة. وقد أُحرز تقدم كبير على صعيد تطوير أجهزة السلسلة، والتقانات المتبعة في السلسلة، وظهرت أجيال مطورة منها على مدى العقد الماضي.

أ- السَلسَلة من الجيل الأول first generation sequencing وهي طريقة تعرب بإنهاء السلسلة chain-termination method التي طورها فريدريك سانجر Frederick Sanger وزملاؤه في عام 1977. حيث تُضخم شدفة محددة من الدنا بواسطة تفاعل البوليمراز المتسلسل Polymerase Chain Reaction (PCR) بوجود كل من النكليوتيدات منقوصة الأكسجين deoxy ribo nucleiotide tri phosphate (dNTPs) ، إضافة إلى النكليوتيدات ثنائية منقوصةالأكسجين (ddNTPs)di deoxy Ribo Nucleiotide Tri Phosphate   التي تكون موسومة بمادة مشعة أو ملونة بصباغ متألق. ويجري لكل شدفة - دنا مراد معرفة تسلسلها - تفاعل له أربعة أنابيب تتشابه جميعها بجميع مكونات التفاعل إلا أن كل واحد منها يختلف عن الآخر بنوع النوكليوتيد ثنائي منقوص الأكسجين، فأحدها يحتوي على ddGTPs، والآخر على ddATPs، والثالث على ddCTPs، والرابع على ddTTPs.

ومن المعلوم أنه في أثناء عملية تركيب سلسلة الدنا (التضخيم وتركيب قطعة جديدة متممة لقالب الدنا) تُضاف النكليوتيدات من النهاية 3´ المحتوية على الفسفات الثلاثية، ولكن في حال وجد  النكليوتيد ثنائي منقوص الأكسجين ddNTPs فلا يستطيع إنزيم تاك بوليمراز Taq DNA polymerase إضافة نكليوتيد جديد، فيتوقف هنا التركيب، ولا يستطيع الاستمرار، فتصبح شدفة مبتورة، ثم يبدأ التفاعل مع قطعة جديدة ببادئة جديدة، وتصنع دنا متممة حتى يُضاف النكليوتيد ثنائي منقوص الأكسجين ddNTPs والتي لن يستطيع بعدها إنزيم التضاعف إضافة نوكليوتيد جديد، وهكذا تستمر تفاعلات البوليمراز المتسلسل حتى تنهي قطع الدنا القالب جميعها. ويتشكل في نهاية كل أنبوب قطع من الدنا بحجوم متزايدة الطول كل واحدة منها تنتهي بنكليوتيد ثنائي منقوص الأكسجين. وتُرحّل العينات من الأنابيب الأربعة على هلام خاص بواسطة تقانة الرحلان الكهربائي وتقرأ النتائج عيانياً، ويوضح الشكل (5) طريقة سانجر في السَلسَلة.

الشكل (5) طريقة سانجر.

طورت تقانة سانجر لتصبح معتمدة على وسم شدف الـدنا باستخدام 4 حوامل كيميائية متفلورة مختلفة طول موجات الإصدار، ولإنهاء تفاعل البلمرة تُستخدم ddNTPs موسومة بتلك الحوامل المتفلورة، إذ يوسم كل واحد من النكليوتيدات ثنائية منقوص الأكسجين الأربعة بواحد فقط منها، وتُميز الشدف الناجمة عن إنهاء تفاعل البلمرة بحسب طول موجة الإصدار الخاصة بكل حامل (التايمين أحمر، الغوانين أسود والأدنين أخضر والستوزين أزرق)، ويُجرى التفاعل في أنبوب واحد، تُفصل الشدف المتفلورة بالرحلان الكهربائي ضمن أنبوب شعري، وتُحلل النتائج بواسطة جهاز آلي مزود ببرنامج حاسوبي خاص كما يوضح الشكل (6).

الشكل (6) تسلسل طريقة سانجر.

ب- السَلسَلة من الجيل الثاني second generation sequencing  ظهر في عام 2005 وفي السنوات اللاحقة جيل جديد من تقنيات السلسلة، لحل محدوديات السلسلة من الجيل الأول. ويعتمد مبدأ السلسلة من الجيل الثاني أو الجيل التالي next-generation على التضخيم النسيليclonal  لجزيء الحمض النووي حيث تُسلسل مليارات الشدف من الحمض النووي المختلفة في الوقت نفسه بطريقة متوازية، وتُوَلد بيانات هائلة، ويُحصل على النتيجة مباشرة من دون الحاجة إلى الرحلان الكهربائي.

ويعتمد نهج السلسلة على: السلسلة من طريق الربط Sequencing By Ligation (SBL) أو السلسلة من طريق التركيب Sequencing By Synthesis (SBS)  أو على ما يسمى السلسلة الحرارية pyrosequencing، ويوضح الشكل (7) مقارنة بين الأساليب المختلفة تلك. وتُصنف على نحو أساسي إلى ثلاث منصات platforms سلسلة رئيسية:

-  Roche/454 التي أُطلقت عام 2005.

-  Illumina/Solexa أُطلقت عام 2006.

- ABI/SOLiD أُطلقت عام 2007.

الشكل (7).

وبصورة عامة يمكن في هذه التقنية ربط شدف الحمض النووي بموائمات adapters قليلة النكليوتيد خاصة بإحدى المنصات المذكورة أعلاه.

تبدأ خطوات السلسلة بإعداد القالب template. الذي يمكن أن يكون الحمض النووي الجينومي gDNA، أو الحمض النووي المترسب مناعياً، أو الحمض النووي الريبي المنسوخ عكسياً، أي complementary DNA (cDNA)

وتتضمن الخطوة التالية إعداد المكتبة؛ في هذه الخطوة يُقطع الحمض النووي الجينومي إلى جزيئات خطية linear DNA molecules بأحجام معينة مناسبة للسلسلة وباعتمادالمنصة المستخدمة ثم تُربط الشدف بموائمات قليلة النكليوتيد خاصة بالمنصة أيضاً.

يجري في الخطوة اللاحقة تضخيم المكتبة؛ تتضمن هذه الخطوة ربط جزء الحمض النووي بخرزة دقيقة microbead (emulsion PCR) أو ربطه بالشريحة الزجاجية ذاتها، فمثلاً تعتمد على تقنية تُعرف باسم التضخيم الجسري bridge amplification (الشكل 8) حيث تُستخدم جزيئات الحمض النووي - بطول يقارب 500 bp– المرتبطة من كل طرف بموائمات مناسبة؛ ركائز لتفاعلات التضخيم المتكررة. وتجري التفاعلات على شريحة زجاجية محتوية على تسلسلات قليلة النكليوتيد متممة للدنا القالب. فعند إدخال عينة الدنا إلى خلية الجريان في الجهاز يتجه الدنا القالب المراد دراسته ليتحد مع المحول، وعند ارتفاع درجة الحرارة يميل الدنا القالب للارتباط من نهايته الثانية (الحرة) بقطعة الدنا الأخرى المثبتة في خلية الجريان والقريبة من السابقة، ثم يشكل إنزيم التضاعف نسخاً من قطعة الدنا القالب، وعند انتهاء الدورة الأولى يُلاحظ أن الدنا القالب عاد لشكله المنتصب (القائم)، ثم في الدورة الثانية بارتفاع درجة الحرارة تنفصل السلسلتان بعضهما عن بعض، ويتحرر الدنا القالب (يُغسل ويُخرج من خلايا الجريان)، وتبقى السلسلة الجديدة مرتبطة بقطعة الدنا المثبتة في خلية الجريان، ثم تميل لترتبط من جهتها الحرة بمتممتها من قطعة الدنا المثبتة بخلية الجريان مشكلة جسراً، ثم تتضاعف، وتتكرر هذه العملية حتى يصل عدد النسخ إلى 1000 نسخة، وتحدث عملية السلسلة  بالتزامن مع التضخيم، ويأخذ الجهاز صورة للأساس عند إضافته للسلسلة المتممة في أثناء تفاعل الـبوليمراز المتسلسل.

تُلتقط صورة لموجات الفلورة التي تطلقها الأسس الآزوتية عند رصفها (إضافتها) في شريط الدنا المصنع حديثاً، فكل أساس آزوتي يعطي لوناً يختلف عن الآخر، ثم تُعالج البياناتبواسطة برنامج حاسوبي يقوم بالتحليل الآني؛ أي يقوم الجهاز بتفسير معنى الألوان التي صُورت  لحظياً، ثم تُحوّل الملفاتإلى ملفات FASTQ  بواسطة برنامج حاسوبي آخر. تحوي ملفات FASTQ معلومات حول تتابعات النكليوتيدات متبوعة بمعلومات عن التسلسل وعن جودته، تدعى هذه العملية الترميز القضباني barcoding، تحلل بعدها النتائج بواسطة برامج حاسوبية أخرى. ويوضح الشكل (9) مراحل إجراء السلسلة من الجيل الثاني.

الشكل (8) التضخيم الجسري.

الشكل (9) مراحل السلسلة من الجيل الثاني.

سمحت هذه التقنيات الحديثة بسلسلة الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA بتوفير طريقة أسرع وأرخص بكثير من طريقة سانجر المستخدمة سابقاً، وعلى هذا النحو أحدثت ثورة في دراسة علم الجينوم والبيولوجيا الجزيئية. ويمكن من خلالها سلسلة كامل الجينوم whole genome sequencing أو سلسلة الإكزونات sequencingExome فقط، أو قائمة محددة فقط من التسلسلات targeted gene panel، ويوضح الشكل (10) الفروقات بين التقنيات الثلاث المذكورة.

الشكل (10) الفروق بين تقنيات السلسلة.

ج- السلسلة من الجيل الثالث third generation sequence من أبرز ميزات هذه التقانة القدرة على قراءة سلسلة طويلة تتجاوز عدة آلاف من الأسس  بتكلفة منخفضة وسهولة في إعداد العينة من دون الحاجة إلى إجراء التضخيم PCRفضلاً عن وقت التنفيذ الأسرع بكثير من تقنية السلسلة من الجيل الثاني.

هناك نهجان رئيسيان يميزان هذه التقانة: الأول يُدعى نهج سلسلة جزيء وحيد في الزمن الحقيقي Single Molecule Real Time  sequencing (SMRT) ، ويعد النهج التقاني الأكثر استخداماً طوره مختبر كويك Quake ، ويعتمد على مبدأ السلسلة من طريق التركيب. أما النهج الثاني فيعتمد على تقنيات القراءات القصيرة الحالية التي تستخدمها Illumina (Moleculo) و10xGenomics لبناء قراءات طويلة.

ففي نهج سلسلة جزيء وحيد في الزمن الحقيقيSMRT  (الشكل 11) يُركَب الحمض النووي ضمن حاويات صغيرة تشبه البئر تدعى موجهات الإشارة في الوضع الصفري Zero-Mode Wave-guides (ZMWs) بوجود أدوات التقاط الإشارة الموجودة في أسفل البئر، حيث يُكتشف التألق الذي يحدث في قاع البئر فقط. وتُنفَذ السلسلة باستخدام البوليمراز غير المعدل والنكليوتيدات التي تحمل علامة متفلورة والمتوفرة بحرية في المحلول. وتنفصل العلامة المتألقة عن النكليوتيد عند دمجه في سلسلة الحمض النووي؛ تاركاً السلسلة الحمض النووي غير المعدل.

الشكل (11) نهج SMRT.

تجدر الإشارة الى أن التطور التقاني القائم على التقانات النانوية قاد إلى تطوير جيل رابع من السلسلة   fourth generation sequencing التي تتيح إنتاجية أعلى وقراءات أطول وبتكاليف أقل. وتهدف هذه التقانة إلى إجراء التحليل الجيني مباشرة في الخلية، ومن ثمَّ تحافظ على الإحداثيات المكانية لسلسلتي DNA وRNA  بدقة، وتمكن من إعادة تعيين قراءات السلسلة إلى السياق النسيجي الأصلي. كما تمكن تقنية السليكون النانوية siliconnanotechnology أن تدفع بالمعلومات عن علم الجينوم إلى الأمام، وتعد مهمة ضمن مجال الممارسة السريرية.

ومن أبرز طرائق السلسلة من الجيل الرابع ما يدعى السلسلة في الموضع In Situ Sequencing (ISS)؛ يظهر الشكل (12) مخططاً  توضيحياً لهذه الطريقة حيث (أ): السلسلة في الموضع المعتمدة على مسبار القفل. يحوّل الحمض النووي الريبي RNA أولاً إلى cDNA في الموضع داخل الخلايا أو الأنسجة باستخدام بادئات معدلة أو عشوائية، يليه إزالة سلسلة الحمض النووي الريبي RNA والتهجين بمسبار القفل المعدل، مما يترك ثغرة بين طرفي المسبار. ثم تُملأ الثغرة -وهي المكان المستهدف للسلسلة- بواسطة البلمرة ثم يُربط الحمض النووي لتشكيل حلقة كاملة من DNA. ويجرى تضخيم متواصل دوار لأجل التضخيم النسيلي للحمض النووي الحلقي؛ مما يولد منتجاً مضخماً يخضع بعدها للسلسلة. (ب): يُنشأ الحمض النووي المتمم cDNAأول مرة من طريق النسخ العكسي في الموضع باستخدام بادئ عشوائي موسوم و dNTP ممزوج مع أمينواليل ديوكسييوريدين 5 ′-ثلاثي الفسفات aminoallyl deoxyuridine 5′-triphosphate (dUTP)، ثم يُربط الحمض النووي cDNA الناتج بالمطرق الخلوي مع كاشف لضمان ثبات الحمض النووي cDNA؛ والحفاظ على المعلومات المكانية. يصبح الحمض النووي cDNA المصنع حديثاً دائرياً بصورة ذاتية؛ ليشكل حلقة من DNA باستخدام إنزيم الربط الحلقيLigase  Circ، يليها إجراء تضخيم نسيلي باستخدام التضخيم المتواصل الدوار. وأخيراً، تجرى عملية السلسلة للجزء الحلقي المستهدف.

الشكل (12) طريقة السلسلة في الموضع.

3- المفاعلات الحيوية

المفاعل الحيوي bioreactorهو جهاز يشبه القِدر الكبير يراوح حجمه من لترات إلى عدة أمتار مكعبة، وغالباً ما يكون مصنوعاً من مواد غير سامة ومقاومة للصدأ وقابلة للتعقيم المتكرر بالبخار الساخن والضغط العالي. يعتمد الجهاز في عمله على مبدأ التخمير fermentation لتنمية الأحياء الدقيقة (البكتريا أو الخمائر) المستخدمة في الصناعات الحيوية وإنتاج بعض المركبات كالتي تدخل في الصناعات الدوائية (مثل المضادات الحيوية واللقاحات) أو من أجل التحويل الحيوي للمخلفات العضوية (مثل المياه العادمة)، وقد تكون العمليات التي يقوم بها المفاعل هوائية أو لا هوائية.

 يوفر المفاعل الحيوي بيئة مناسبة للكائن الحي؛ لينتج المادة المرغوبة بكفاءة عالية ضمن شروط مضبوطة درجة الحرارة ودرجة الحموضة (الباهاء pH). وتتعدد التطبيقات التي تعتمد المفاعلات الحيوية: من إنتاج المستحضرات الصيدلانية والأغذية إلى إنتاج الوقود الحيوي، لذا فهي تعد أداة مهمة للباحثين والمهندسين الذين يتطلعون إلى تسخير قوة الأنظمة الحية لمجموعة متنوعة من الأغراض، على سبيل المثال: يمكن تنمية الخلايا مثل خلايا الثدييات والحشرات في المفاعلات الحيوية واستخدامها لأجل إنتاج مجموعة من البروتينات، مثل الأجسام المضادة ولا سيما الأضداد وحيدة النسيلة monoclonal antibodies والإنزيمات الخام (المنتجة تجارياً) مثل إنزيم الليباز lipase والمنفحة (الخمائر المستخدمة في العجين) وبروتينات النمو المفلورة Growth Fluorescent Proteins (GFP) ، التي تُستخدم في الهندسة الوراثية بكثرة، وكذلك تؤدي المفاعلات الحيوية دوراً مهماً في إنتاج اللقاحات الفيروسية، وفي الآونة الآخيرة كان لها مساهمة واسعة في إنتاج اللقاحات الخاصة بفيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 Severe Acute   Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS‑CoV‑2)       المسبب لمرض كوفيد 19  COVID19.

وللمفاعلات الحيوية دور مهم في هندسة النسج tissue engineering ولها ثلاثة استخدامات رئيسية: الحفاظ على بيئة خلوية دقيقة محددة، سواء كانت فيزيولوجية أم مرضية، من أجل فهم أفضل للخلايا والفيزيولوجيا الجزيئية/ المرضية ؛ تكثير الخطوط الخلوية للعلاجات الجينية/الخلوية أو تنمية النسج في المختبر in vitro للاستخدام في التطبيقات السريرية؛ واختبار العلاجات المحتملة للأهداف العلاجية الجديدة. يوضح الشكل (13) أحد التطبيقات السريرية العلاجية التي تستخدم المفاعلات الحيوية من خلال هندسة الطعوم grafts النسيجية العظمية حيث: (أ) يُفحص المرضى المصابون بعيوب في الهيكل العظمي (باللون الأحمر) الناجمة عن التشوهات الخلقية أو الأمراض أو الصدمات وتحديد أماكن الإصابة من أجل إعادة بناء العظام. (ب) خلايا كفؤة عظمية خاصة بالمريض مستمدة من: i- أنسجة بالغة ؛ ii- الخلايا الجذعية المحرضة المتعددة القدرات؛ أو iii- تُربط الأكياس الأريمية blastocysts المتولدة من طريق نقل النوى من خلايا جسمية إلى (ج) سقالات scaffolds ذات ثقوب مسامية ثلاثية الأبعاد لجمع مواد حيوية من طبيعة وبنية مختلفتين، وتُزرع في ظل ظروف ديناميكية في (د) أنظمة المفاعلات الحيوية التي تعزز نمو النسج العظمية من خلال دعم التغذية الكافية للخلايا المستزرعة وتطبيق المحفزات الميكانيكية الحيوية للتجدد الوظيفي.

الشكل (13) استخدام المفاعلات الحيوية في هندسة الطعوم النسيجية العظمية.

للمفاعلات الحيوية أيضاً استخدامات سريرية أخرى، إذ تطلب إدارة الغذاء والدواء Food and Drug Administration (FDA) اختبار العديد من المستحضرات الصيدلانية والغرسات implants على نماذج حيوانية قبل السريرية pre-clinical animal models. غير أن المفاعلات الحيوية لديها القدرة على استبدال نماذج الاختبار الحيواني قبل السريرية، مثل اختبار الغرسات الطبية الحيوية وتسهيل بذر الخلايا cell seeding على السقالات، وبذلك توفر الجهد والوقت والمال.

ولا يقتصر استخدام المفاعلات الحيوية في التقانات الحيوية للاستخدام العلاجي والطبي، بل تُستخدم في صناعة الأغذية والمشروبات مثل الحليب وإنتاج الخميرة والجعة.

وتُستخدم المفاعلات الحيوية الضوئية photo bioreactors لزراعة الكائنات الحية التي تستخدم التمثيل الضوئي، مثل الطحالب والبكتريا الزرقاء وتطويرها لإنتاج الوقود الحيوي. كما يمكن أن تستخدم المفاعلات الحيوية المنتجات النباتية مثل الذرة وقصب السكر أيضاً لإنتاج الوقود الحيوي مثل الإيتانول الحيوي. وكذلك يمكن تصنيع بعض المواد الكيميائية مثل الإتانول وحمض الخل وحمض الليمون وحمض اللاكتيك.

 4- تقنيات التعديل أو التحرير الجيني gene editing techniques

يصف التعديل الجيني عملية تعديل الشيفرة الجينية أو جينوم الكائن الحي باستخدام تقنيات وأدوات مختلفة. ومن أبرز أهداف تقنيات التعديل الجيني فهم وظيفة جين معيّن أو عنصر تنظيمي جيني أو التعدد الشكلي الأحادي النكليوتيد؛ إذ تعود قرابة نصف التغيرات الجينية المسببة للأمراض الحالية إلى التعدد الشكلي الأحادي النكليوتيد. ومن ثم، هناك حاجة واضحة لتطوير طرائق وأدوات قادرة على تصحيح إدخال تغيرات أحادية النكليوتيد بكفاءة عالية لتحسين التفسير السريري وفهم كيفية تأثير الاختلافات الجينية البشرية في الصحة. ولاكتساب مثل هذه المعرفة يجب أن تظهر تقنية ذات كفاءة عالية في تحديد الهدف وتعديله في موقع محدد وتقليل التعديلات غير المستهدفة.

 تعتمد هندسة الجينوم على جانبين: ظاهرة القطع-التي تُجرى بشكل مصطنع، وآلية الإصلاح التي تُحفّز بواسطة القطع، والتي تتحقق بشكل طبيعي. وثمة تقنيات مختلفة لتعديل الجينات. وبغض النظر عن التقنية المحددة المستخدمة؛ فإن التقنيات جميعها تعتمد على استخدام إنزيمات تسمى «النوكليازات» nucleases التي تتآثر مباشرة مع الحمض النووي في الخلية مستهدفة موقعاً محدداً داخل الجينوم، وبمجرد أن يتعرف الإنزيم على الموقع المستهدف؛ يرتبط به ويقطعه مولداً بذلك خيطاً مفرداً من الحمض النووي. تُعرف هذه الإنزيمات بإنزيمات التقييد أو التحديد restriction enzymes التي تعد سلفاً رئيساً لتقنيات التعديل الجيني الحديثة. وقد تحققت خطوة مهمة في مجال هندسة الجينوم من خلال تقنية تدعى "التكرارات العنقودية القصيرة المتناوبة منتظمة التباعد (كريسبر)"Clustered  Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)   وهي واحدة من أهم الاتجاهات في مجال التقانة الحيوية اليوم في عالم الطب.

وتُعرف أنظمة كريسبر في الأصل بأنها نظام حماية طبيعية تستخدمه البكتريا ضد غزو العاثيات bacteriophages. وقد وظَّفت واستُفيد منها في الوقت الحاضر لتعديل الجينات من طريق تحفيز إحداث كسور مزدوجة في الحمض النووي أو شطر الحمض النووي الريبي RNA في مواقع معيّنة يحددها الباحث ضمن الخلايا أو الكائنات الحية.

وتُعد طريقة كريسبر- كاز9 (CRISPR-Cas9) أكثر الطرائق تنوعاً والمتاحة في السوق حالياً. ويعتمد نظام CRISPR-Cas9 على معقد مؤلف من مكونين: بروتين الكاز غالباً Cas9 (المرتبط بكريسبر CRISPR) الذي يقوم بالنشاط الإنزيمي. ودليل الحمض النووي الريبي (gRNA)guide RNA  الذي يقود المعقد إلى الموقع الجيني محل الاهتمام من خلال تماثل تسلسل gRNA مع الحمض النووي الجيني، ويشكل عند الارتباط به معقداً مزدوجاً  duplex RNA-DNA. ويوضح الشكل (14) مخططاً توضيحياً لـطريقة CRISPR-Cas9 من أجل التعديل الجيني؛ إذ يمارس بروتين Cas9 نشاطه الإنزيمي كنكلياز داخلي، ويحدث كسراً مزدوجاً (DSB) في الحمض النووي المستهدف، الأمر الذي يحفز إطلاق أحد مسارات إصلاح الحمض النووي في خلايا الثدييات وتفعيلها: وهي إما بضم النهايات غير المتماثلة Non-Homologous End Joining (NHEJ)؛ وإما بالإصلاح المباشر المتماثل Homology-Directed Repair (HDR) .

الشكل (14) طريقة كريسبر- كاز9.

وقداعتُمدت هذه التقانة اعتماداً كبيراً في جميع تخصصات علوم الحياة؛ بدءاً من الأبحاث الأساسية والصيدلانية إلى التطبيقات في الزراعة والعلاج الجيني. ومن المؤكد أنها تفوقت على أسلافها من حيث سهولة الاستخدام وكفاءة التعديل. ويوصى بها جداً في التطبيقات التي تستلزم إجراء تعديلات متزامنة متعددة داخل الخط الخلوي نفسه أو الكائن الحي نفسه.

ومع ذلك فإن تقانة كريسبر ليست الحل لجميع مشكلات هندسة الجينوم الحالية؛ إذ يحتاج كل باحث إلى اختيار طريقة تعديل مناسبة وصحيحة فضلاً عن الأدوات الداعمة لتحقيق أهدافه. ومع ذلك ما تزال هناك بعض التحديات التي تواجه تقنية CRISPR-Cas9. فعلى الرغم من خصوصيتها العالية؛ فإن المعايير الأخرى مثل كفاءة طريقة تعداء الخلايا cell transfection (عملية إدخال مواد أجنبية للخلية بإحداث ثغرات في الغشاء البلاسمي للخلية) المختارة والإبقاء على الخلية حية في أثناء إجراء طريقة النقل تؤثر بشدة في نجاح تجربة التعديل. والتحدي الآخر لهذه التقنية هو تقليل التعديل خارج الهدف الذي ما يزال حاسماً؛ ولا سيما في مجال التطبيق السريري.

وللتغلب على محدوديات طرائق تعداء الخلايا طورت شركة سيتوسرج  Cytosurge تقنية خاصة بها تعتمد الفحص المجهري باستخدام القوة المجهريةforce  microscopy تجمع بين الميزات الفريدة للموائع الدقيقة microfluidics وميزات المجهر ذي القنوات المجهرية المغلقة ومسابر حساسة للقوة؛ إذ تحوي المسابر فتحات يصل قطرها إلى 300 نانومتر تسمح بتوزيع أحجام من قيمة فيمتولتر femtoliter أو شفطها. وقد حصلت الشركة على  براءة اختراع الفحص المجهري للقوة المائعية Fluidic Force Microscopy (FluidFM®). وتعد أفضل طريقة دقيقة عالية الكفاءة لإجراء هندسة الجينوم، وهي التقانة الوحيدة لتعديل الجينات التي توفر حقناً مباشراً داخل النواة لخلية واحدة مع كفاءة عالية في الإصلاح المباشر المتماثل HDR، ويوضح الشكل (15) تطبيق كريسبر بالاستفادة من تقانة الفحص المجهري للقوة المائعية ومبدأ العمل.

الشكل (15) تطبيق طريقة كريسبر.

وقد وفرت حلاً فريداً ضمن المختبر in vitro لإجراء إيصال مباشر داخل النواة يحافظ على الخلية على قيد الحياة؛ بسبب طريقة التعداء الدقيقة للغاية المعتمدة على الحقن بالنانو.ويضمن الحقن أو الاستخراج الدقيق الحفاظ على حياة الخلية، وتعد هذه الطريقة مناسبة خصوصاً للخلايا التي يصعب نقلها والأنواع الخلوية النادرة. وتسمح بزيادة كفاءة تطبيق تقانة كريسبر وإمكانيتها عبر مجموعة متنوعة من الأنواع الخلوية ومجالات البحث.

ويمكن استخدام تقنية  FluidFM®  طريقة داعمة مع تقنية كريسبرفي ثلاثة استخدامات شائعة:

1-   التعديل الجيني لتحليل وظيفة الجين. يمكن إدخال التعديلات الجينية - في المناطق المرمزة وغير المرمزة - على نحو مصطنع  ومن ثم دراستها.

2-  الكشف عن أهداف دوائية جديدة من طريق المسح الجيني. يمكن إجراء المسح الجيني باستخدام نهج تجريبي واسع النطاق، يتضمن فقداناً أو كسباً وظيفياً للجينات قيد الدراسة مصمم لاكتشاف الجينات أو التسلسلات الجينية التي تؤدي وظيفة أو نمطاً ظاهرياً محدداً. 3-  تتبع علامات توضع على الخلية بناءً على بروتين متفلور مضاف إلى جين محدد. يمكن وضع علامة على البروتينات الداخلية من دون الحاجة إلى الجينات الناقلة.

تؤدي تلك الاستخدامات إلى مجموعة واسعة من التطبيقات المهمة مثل اكتشاف الأدوية الجديدة وتطويرها، والتشخيص لتحديد الأمراض المعدية وغير المعدية، ونمذجة المرض disease modeling لعلاج الأمراض التي تنشأ من التغيرات الجينية؛ إذ يمكن أن يُستخدم التعديل الجيني لنمذجة الأمراض؛ في الجسم الحي أو في المختبر على حد سواء.

5-  تقنيات استخلاص الحموض النووية وعزلها

يعد استخلاص الحموض النووية من العينات البيولوجية خطوة أساسية في التحليل الجيني وعدة من التطبيقات المهمة، تُستخلص الحموض النووية (DNA،RNA) من خلايا النسج ومن الزروعات الخلوية باستخدام تقنيات متعددة تختلف فيما بينها بالطريقة المتبعة والمواد الكيميائية المستخدمة، ولكنها تتفق بالمبدأ،إذ تضم التقنيات المطبقة جميعها الخطوات الرئيسية الآتية:

-  حلّ الخلايا cell lysis.

- التخلص من الأغشية الخلوية (الليبيدات) بإضافة منظف (محلول صابوني detergent) كالـ Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)، وحل البروتينات باستخدام البروتيناز protease كالبروتيناز K.  

-  ترسيب الـ DNA  بالكحول كالإتانول أو الإيزوبروبانول.

وعلى الرغم من اكتشاف عدة طرائق للعزل والاستخلاص، ما يزال من الصعب عزل الحمض النووي عن مجموعات صغيرة من الخلايا أو عن الخلايا المفردة وتحليله؛ إذ يعد تحليل الجينوم على مستوى الخلايا المفردة مهماً في أبحاث علوم الحياة والطب الحديث في تطبيقات تتناول تشخيص السرطان وفهم نمو الأنسجة.

ومن أبرز التقنيات المتبعة في استخلاص الحموض النووية ما يأتي:

أ‌-  تقنية الموائع الدقيقة: طُوِّرت أجهزة بأحجام صغيرة لاستخلاص الحموض النووية  DNA/RNA، وهي ذات فعالية وحساسية عالية بسبب العمل ضمن نظام مغلق؛ ومن ثم تقليل فرصة الخطأ البشري والتلوث المتبادل. ومع ذلك فإن أحجام الكواشف المنخفضة اللازمة تمنح أجهزة الموائع الدقيقة ميزة واضحة في خفض تكلفة التشغيل. وقد صُمم جهاز قادر على التقاط خلية واحدة وإجراء الحل، والاستخلاص، والتنقية للحموض النووية منها. ويوضح الشكل (16) نموذجاً عن إحدى تلك الأجهزة. (أ) تُحجز خلية واحدة في حجرة صغيرة. (ب) تُحَل الخلية التي التُقطت بواسطة وقاء (دارئ)  buffer انتقائي للغشاء الخلوي. (ج) يُفصل الحمض النووي الريبي RNAعن النواة السليمة، ويُنسخ عكسياً إلى cDNA. (د) بعدها يخضع الحمض النووي (cDNA) والحمض النووي (gDNA) للتضخيم بالكامل.

الشكل (16) مخطط ترسيمي لعمل جهاز الموائع الدقيق لاستخلاص الحمض النووي  DNAوالحمض النووي الريبي RNA من خلية واحدة فقط.

 وجدير بالذكر أن الأساليب القائمة على الموائع الدقيقة توفر منصة مثالية لتضخيم الحموض النووية؛ إذ طورت أساليب عدة في تضخيم الحموض النووية المعتمدة على نظام الموائع الدقيقة محققة بذلك سرعة ودقة في الإنجاز. ودُمجت أغشية رقيقة من المعدن (معظمها بلاتينيوم) أو بولي سليكون مباشرة في أجهزة الموائع الدقيقة في أثناء تصنيعها لزيادة تصغير أجهزة PCR الموائع الدقيقة وتسريع العملية الحرارية كما يبين الشكل (17).

الشكل (17) شريحة PCR مكونة من أغشية رقيقة حرارية من بولي دايميثيل السيلوكسان Polydimethylsiloxane (PDMS).

ب‌-طريقة الخرزات الممغنطة magnetic beads: تُستعمل خرزات دقيقة من الكوبالت والمنغنيز المرتبط بأجسام مضادة تستهدف الحموض النووية DNA/ RNA وتعتمد على الوزن الجزيئي وكمية العينة. وميزات هذه الطريقة هي الاقتصاد في الوقت المستنفد بالتثفيل وتوفير كمية كبيرة من العينة عالية النقاوة (الشكل 18).

الشكل (18) استخدام الخرزات الممغنطة في استخلاص الحموض النووية.

ج - طريقة الاستخلاص باستخدام الجسيمات النانوية nanoparticles: يكون لتلك الجسيمات ألفة عالية تستهدف الحموض النووية DNA/RNA، فترتبط بهامثلالجسيمات النانوية ذات اللب الممغنط والسطح المطلي بالألكيليميدازوليوم alkylimidazolium.

د‌-    طريقة الطور الصلب Solid Phase Extraction (SPE): يُستخدم فرق الألفة بين المادة التحليلية والمواد المتداخلة الموجودة في السائل. وتسمح الألفة بفصل المادة التحليلية المستهدفة عن المواد المتداخلة، وغالباً تعتمد هذه الطريقة على الفصل بوساطة أعمدة تحوي مواد معينة تحجز الحموض النووية فيها من مثل السليكا؛ إذ يُستخدم أنبوب صغير في أسفله طبقة من السليكات الموجبة الشحنة؛ إذ تُحجز فيه جزيئات الدنا فقط كما يتضح من الشكل (19).

الشكل (19) طريقة الطور الصلب.

6-  تقنية الرحلان الكهربائي electrophoresis:

تقانة تُستخدم في المختبر من أجل فصل الجزيئات المشحونة  كهربائياً، تُفصل الجزيئات الضخمة macromolecules خلال وسط مناسب matrix عند تطبيق حقل كهربائي. وتعود فكرة استخدام الكهرباء لفصل الجزيئات الحيوية إلى عالم الكيمياء الحيوية آرن تيسليوس Arne Tiselius الحاصل على جائزة نوبل لعام 1948 لهذا الاختراع. ويعد الرحلان الكهربائي إحدى تقنيات التحليل البسيطة المستخدمة لفصل جزيئات الحموض النووية (الدنا والرنا) أو البروتينات بناءً على حجمها و/أو شحنتها الكهربائية بواسطة تطبيق مجال كهربائي في وسط هلامي؛ إذ ترحل الحموض النووية - نتيجة شحنتها السالبة - من القطب السالب إلى القطب الموجب. وأهم تقنيات الفصل الكهربائي الشائعة الاستخدام ما يأتي:

أ‌-     الفصل الكهربائي في الهلام Gel electrophoresis: تعد هذه التقنية من أكثر التقنيات استخداماً في مجال البيولوجيا الجزيئية، يُستخدم لفصل الحموض الريبية النووية (DNA،RNA ) والبروتينات ضمن الهلام باستخدام التيار الكهربائي. ويُستخدم هلام من الأغاروز agarose (الرحلان الكهربائي الأفقي) أو بولي أكريلاميد polyacylamide (الرحلان الكهربائي العمودي) وسطاً مناسباً في الفصل. تُفصل الجزيئات في الهلام بالاعتماد على الحجم (طول) والشحنة والبنية. وتُفصل البروتينات في الهلام بالاعتماد على الحجم والبنية والشحنة، إذ تُفصل الحموض الريبية النووية (DNA،RNA ) بالاعتماد على أطوالها bpبتمرير شحنات كهربائية في الهلام بعد وضعه في حوض مسطح أفقي أو عمودي مغمور بسائل يتصل من جهة بقطب كهربائي موجب؛ ومن جهة أخرى بقطب كهربائي سالب. وتوضع الحموض النووية أو البروتينات في حفر صغيرة wells أُعِدَّت في الهلام باستخدام أمشاط خاصة combs، وتقع هذه الحفر عند الطرف السالب للحوض. توضع كل عينة من المادة المراد فصلها في إحدى هذه الحفر باستخدام ماصة pipet. يُمرَّر التيار الكهربائي في الهلام لدفع الجزيئات كهربائياً من القطب السالب إلى القطب الموجب. وترحل الشدف الصغيرة بسرعة عبر الهلام في حين تكون حركة الشدف الكبيرة بطيئة.

ولا يمكن رؤية جزيئات الحموض النووية المنفصلة ضمن المادة الهلامية إلا بعد غمس هذه المادة في ملون خاص مثل بروميد الإثيديوم ethidium bromide الذي يتحد مع جزيء الدنا؛ فيسهل تمييزه. وميزة استخدام هذا النوع من الصباغ أنه يتألق  fluorescent بلون برتقالي لامع إذا ما ارتبط بجزيئات حمض الدنا، وفُحص في ضوء فوق بنفسجي (الشكلان 20 و21).

جدير بالذكر أن الفصل الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد يعد تقانة شائعة لدراسة البروتين؛ إذ تُستخدم لفصل بروتينات مختلفة بالاعتماد على شحنتها أو حجمها. وتُستخدم أيضاً لفصل شدف من الـDNA  التي تكون بأطوال أقل من 500 bp، ويمكن من خلالها أيضاً تمييز شدف تختلف عن بعضها بزوج واحد فقط من الأسس (1bp).

الشكل (20) الرحلان الأفقي.

الشكل (21) الرحلان الكهربائي العمودي: أ- الجهاز واتجاه الرحلان الكهربائي، ب- فصل الجزئيات الكبرية عبر ثقوب الهلام.

ب‌- تقنية الفصل الكهربائي على هلامة دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي الأكريلاميد Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE): تُستخدم هذه التقنية لمعرفة الكتلة الجزيئية لمكونات خليط من بروتينات مختلفة أو للتحقق من نقاوة بروتين معين معتمدةً على الفصل الكهربائي ضمن هلامة SDS-PAGE. وهذه الطريقة خاصة بالتحليل النوعي لخليط من البروتينات. تضاففي هذه التقنية عينة البروتين إلى محلول ذي أس هدروجيني معين يحتوي على مادة بتا ميركابتوإتانول β-mercaptoethanol وعلى صبغ متأين مثل بروموفينول الأزرق bromophenol blue وعلى مادة سالبة الشحنة، وهي كبريتات دوديسيل الصوديوم sodium Dodecyl Sulphate،يُسخن المحلول مدةَ خمس دقائق، تعمل في أثناء ذلك مادة بتا ميركابتو إتانول باختزال أي روابط ثنائية الكبريت في البروتينات المدروسة؛ مما يسمح بتمدد سلاسل عديد الببتيد، وبعد ذلك يرتبط مركّب SDS بهذه السلاسل مُفقداً البروتين طبيعة بنائه المعقدة؛ ليتحول إلى سلاسل خطية من الحموض الأمينية ذات الشحنات السالبة.

تتضمن الهلامة طبقتين من الهلام: هلامة الفصلrunning gel  وهلامة الرزم stacking gel  حيث تكون الطبقة السفلى هلامة الفصل؛ المسؤولة عن فصل البروتينات وفق حجمها، والطبقة العليا هلامة الرزم تحوي الآبار وهي مصممة لرزم البروتينات أو تكديسها ضمن طبقة رقيقة حتى تصل إلى هلامة الفصل، ويكون تركيز البولي أكريلاميد فيها منخفضاً؛ مما يعني أن ثقوبها كبيرة. ويؤدي ذلك إلى أن تتركز الجزيئات وترتص على نحو كبير ضمن هذه الهلامة، ويساهم ذلك في دقة فصل المكونات ضمن هلامة الفصل. وبعد انتهاء الفصل والرحلان الكهربائي يُنقل اللوح الهلامي إلى وعاء يحتوي على محلول ملون مثل أزرق كوماسي coomasse blue عدة ساعات، ثم يُغسل اللوح لإزالة الصبغ العالق بالهلامة وغير المرتبط بالبروتين، وتظهر البروتينات المرتبطة بالصبغ كحزم bands ذات لون أزرق (الشكل 22).

الشكل (22) تقنية الفصل الكهربائي على هلامة(SDS-PAGE) .

ج- تقنية التركيز بالتماثل الكهربائي isoelectric focusing: تعمل الطرائق السابقة على تجميع جزيئات الحمض النووي التي لها الوزن الجزيئي نفسه في حزمة واحدة من دون أن تتمكن من فصلها حسب نوعها. ويمكن التغلب على هذه المشكلة باستخدام تقنية التركيز بالتماثل الكهربائي التي تعتمد حقيقة أن لكل قطعة من قطع الحمض النووي نقطة تماثل كهربائي معيّنة عند أس هدروجيني سالب. وعند هذا الأس الهدروجيني يكون صافي الشحنة على الحمض النووي يساوي صفراً. وتختلف قطع الحمض النووي المتماثلة بالوزن الجزيئي في نقطة تماثلها الكهربائي بسبب اختلافها في نسب مكوناتها عن القواعد الآزوتية؛ مما يؤدي إلى الاختلاف في عدد الشحنات الموجبة والسالبة الموجودة عليها. وتصل الجزيئة إلى نقطة التماثل الكهربائي (التي تتعادل فيها الشحنات السالبة مع الموجبة لتصبح الشحنة الكلية مساوية الصفر) عند هجرتها في وسط متدرج الأس الهدروجيني السالب، وتكتسب في أثناء حركتها الشحنات الكهربائية حتى تصل إلى حالة الاتزان في شحناتها الكهربائية، ويكون ذلك عند أس هدروجيني سالب معين. وتتوقف الجزيئات عن الحركة عند هذا الموضع وهي في حالة الاتزان. ويمكن استخدام هلامة الأغاروز أو البولي أكريلاميد لفصل شدف الدنا المختلفة الأوزان الجزيئية، ومن ثم توضع الهلامة أفقياً على هلامة لها قيم تماثل كهربائي متعددة مثل هلامة البولي أمفوليت، ثم يُسمح لها بالهجرة الكهربائية رأسياً لتُفصل الجزيئات المتشابهة الوزن الجزيئي اعتماداً على قيم التماثل الكهربائي لها.

7-تحليل الحموض الأمينية وسلسلتها

 تُستخدم تقنية تحليل الحموض الأمينية في فصل المركّبات الحيوية وتشخيصها، وتنقية الإنزيمات والبروتينات المختلفة، وكذلك تنقية الأجسام المضادة والبروتينات الناقلة والأغشية والدقائق والبروتينات السكرية.

 وهناك ما يزيد على ثلاثمئة حمض أميني، بعضها صنعي، والآخر طبيعي، وهي تُستخدم في اصطناع البروتينات لأغراض بحثية وتجارية. وتتحدد وظائف البروتينات بناءً على تركيبها من الحموض الأمينية. ولهذا، فإن كميات الحموض الأمينية وتسلسلها وطبيعتها تُستعمل لتوصيف البروتينات. وقد طُور كثير من أجهزة تحليل الحموض الأمينية التي تزود الباحثين بالمعلومات المهمة عن كمياتها وأنماطها.

أ‌-   أجهزة تحليل الحموض الأمينية amino acid analyzers: وهي أجهزة تُدار آلياً بواسطة الحاسوب، حيث تُحقن العينة البروتينية المراد تحليلها -بعد تحضيرها-  في جهاز الجمع collection device المربوط بأجهزة أخرى تعمل عملاً مبرمجاً على فصل الحموض الأمينية المكونة للبروتينات. ولجميع أجهزة تحليل البروتينات وحدة رئيسية تسمى وحدة الاستشراب أو عمود الاستشراب chromatography column، وهي تعمل على فصل الحموض الأمينية المختلفة بناءً على خواصها الكيميائية. فبعد تفكيك مكونات العينة البروتينية المذابة في محلول خاص إلى حموضها الأمينية يُضَخٌّ ذلك المحلول عبر وحدة الاستشراب التي تقوم بفصل كل حمض أميني بصورة مستقلة. عند ظهور الحموض الأمينية المنفصلة تُخلط بمحلول النينهدرين ninhydrin؛ وتُمرر عبر ملف التفاعل للسماح بتكوين منتج النينهدرين الملون. تمرر الحمض الأمينية المنفصلة عبر جزء آخر من الجهاز يسمى الكاشف detector، وهو يطلق شعاعاً ضوئياً لقياس كمية كل حمض أميني يقطع الشعاع. ثم تظهر النتائج على شكل رسم بياني يسمى منحني فصل التراكيز chromatogram. وهذه الخطوط البيانية تدل الباحث على كمية كل حمض أميني موجود في البروتين المدروس (الشكل 23).

الشكل (23) مراحل كشف مكونات البروتين من الحموض الأمينية.

ب- أجهزة سلسلة الحموض الأمينية amino acid sequencers: وهي الأجهزة المستخدمة لتحديد تسلسل الحموض الأمينية المكونة لبروتين معين، إذ يمكن تحديد الطبيعة الكيميائية والشكلية للبروتينات بعد معرفة تسلسلات الحموض الأمينية فيها، ويمكن بعد ذلك استعمال هذه المعلومات لحساب النظام التقريبي للبرمجة الوراثية للبروتين، ومن ثم تحديد مواقع المورثات في الجينوم genome. وقد كانت عملية تحديد تسلسل الحموض الأمينية في السابق تعتمد على طرائق تقليدية تتصف ببطئها وعدم دقتها. إضافة إلى أنها كانت تخضع للكثير من العمليات الحسابية المعقدة لتحديد الترتيب الصحيح للحموض الأمينية، وربما أحياناً كان الأمر يتطلب إعادة العملية مرات متعددة لضمان الحصول على معلومات دقيقة؛ مما يعني المزيد من الوقت والتكاليف. أما الآن؛ فقد طُوِّرت أجهزة سلسلة الحموض الأمينية آلياً للتغلب على عيوب الطرائق التقليدية جميعها.

يتألف جهاز السلسلة من قطع محكمة من المعدات المرتبطة بعضها ببعض، وتدار آلياً على نحو مبرمج من خلال حاسوب مرتبط بالجهاز. ومن أهم مكونات الجهاز منطقة التفاعل، وجامع العينة، ووحدة الاستشراب، وكاشف مرتبط بالحاسوب. بعد تحضير العينة البروتينية المراد تحديد تسلسلها؛ تُدْخَل إلى منطقة التفاعل؛ ليجري فيها وَسْمُ النهاية N (N-terminus) بمادة كيميائية تسمى فينيل إيزوثيوسياناتPhenylisothiocyanate (PITC) ، حيث يعمل PITC بمنزلة نقطة البداية لتفكيك البروتين. تسمى هذه الطريقة بطريقة السلسلة من النهاية الأمينية أوNN-terminus sequencing . بعد وَسْم النهاية Nتُضاف مادة كيميائية تسمى حمض ثلاثي فلورو أسيتيك Trifluoroacetic لكسر البروتين إلى مكوناته الرئيسة؛ لتُمرر عبر وحدة الاستشراب بغية فصل هذه المكونات من الحموض الأمينية وتنقيتها.وبعد ذلك تمر الحموض الأمينية المفككة عبر الكاشف لتحديد نوع الحمض الأميني على شكل منحنٍ بياني يظهر على شاشة الحاسوب، أو يُطبع على ورقة. ويمكن لهذا النوع من الأجهزة أن يحدد تسلسلات أقصاها 50 حمضاً أمينياً للبروتين المدروس، ولهذا يجب تقطيع البروتينات الضخمة إلى أجزاء أصغر.